博士期间的学习是个思考和历练的过程，由粗而细、由博而专。在这个过程中，我们不断创造和开放思维，我们深度学习，曲径通幽。研究之路，一开始是在前人走过的宽广平坦的大路上，有路可循，而后逐渐变成了羊肠小道，最后可能荒野无路可循。每天面对海量的文献，繁琐的实验，实验方法的熟练操作变得尤为重要。博士研究生学术工作坊“研学视界”主题活动优秀作品为大家分享高效液相使用的相关经验。

高效液相使用经验分享

高效液相是目前科研实验中十分常用的设备之一，在医药研究中，高效液相主要用于成分的定性定量及化合物的分离等。从大四毕业实习开始我最初接触到高效液相，而随着研究的逐渐深入，对它的了解也逐渐加深。回顾我在5年来的研究学习，所参与的课题实验无一离开高效液相，当然在这过程中遇到了很多问题。这里我主要对自己使用过程中所遇到的问题加以总结同大家分享，希望对大家后续的实验带来一些帮助。它的原理、设备构造在仪器的说明书以及各大论坛中都能下载到，我就再不对这些内容进行赘述了。那么它在使用过程有什么需要注意的呢？

1.样品准备：需要经微孔滤膜过滤方可进样，以防止溶液中沉淀堵塞色谱柱；

2.流动相：使用前需要经过过滤，并超声排气；水相需要每天更换，否则水中滋生的微生物可能堵塞仪器；

3.色谱柱：色谱柱的状态通常影响保留时间、化合物分离度等，从而影响实验结果。使用新的色谱柱需要进行活化，活化方法可参照色谱柱说明书。通常使用一段时间色谱柱的柱压与最初相比会有一定变化，因此需要注意的是首次使用时详细记录不同流动相比例下色谱柱的柱压，以此与后续的柱压对比，判断色谱柱的状态（堵塞则柱压变高；色谱柱塌陷则柱压明显下降）。

4.流动相排气：排气前需将排气阀适度打开（通常旋转90°），岛津仪器仅需要设置排气时间，安捷伦则需要手动设置参数（一般流速5ml/min，时间5min）。排气结束后旋紧，感觉有阻力即可，否则长时间会损伤垫片。

5.检测器的选择：我们现在最常用的检测器主要是紫外检测器，紫外检测器吸收波长为200~400nm，但实际上不是所有成分都可以用紫外检测器检识，化合物结构中存在共轭的不饱和键才具有紫外吸收。液相还可配备蒸发光检测器、示差检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器等，在我们学校的仪器共享平台中这几种检测器均可以申请使用。而除了紫外检测器外，蒸发光检测器和二极管阵列检测器也同样常用。其中蒸发光检测器可用于检测某些不能紫外吸收的成分，如某些皂苷类化合物。二极管阵列检测器（即岛津公司的PDA检测器、安捷伦公司的DAD检测器），具有全波长扫描功能，能够通过设置检测器参数对运行时间内的全波长进行扫描和存储，运行结束后也可随意调取扫描范围内的任意波长的图谱，通常用来确定目标成分的最大吸收波长，或用于确定指纹图谱的吸收波长。

6.色谱柱影响：色谱柱填料有很多种，最常用的为反向C18，它是影响成分分离的最主要因素之一，针对不同化合物特性需要选择适宜的色谱柱。因此，某些时候大家进行条件优化时，如不能得到理想分离效果时，除了调整流动相外，还可以尝试更换色谱柱型号，说不定换个柱子同样条件就能得到理想条件。有些小伙伴可能会担心方法的重现性，其实不必，即使是新建药品标准，色谱条件是可以规定色谱柱型号的，如《中国药典》（2020年版）中桔梗皂苷D的检测就规定了色谱柱的品牌及型号。

7.进样前注意检查参数：通常我们在优化好方法之后会建立并保存自己的方法文件，再次使用可以直接调取。但通常仪器并不是一段时间只能一个人用，那么进样前，一定要对调取的方法进行检查，因为液相关机后一般会保存上一次运行的条件，如果接着使用仪器的同学不小心或者直接在你的条件上做了更改并保存，再次调取的则为更改后的条件，直接调取方法运行，冥冥之中就做了无用功。

高效液相常需设置参数有哪些呢？

1.进样器——进样量范围取决于设备安装的定量环大小，分析液相要比制备液相的小（通常分析检测进样5、10、20μl，进样量太低那么定量环取样不准，太高则浪费样品）；
2.泵——流动相组成及比例，流速（通常1ml/min）；常用的有机相为乙腈和甲醇，水相可加入微量酸、碱或缓冲盐，以通过调整色谱峰出峰时间、分离度等，得到理想的色谱图。大多加酸，如甲酸、乙酸、磷酸、高氯酸等，但需要注意以下几点：首先所有加入的添加剂均应是色谱级；其次，添加剂在近紫外区具有吸收，因此一般在210nm左右具有一定的基线干扰，酸的种类不同对成分的分离影响不同，在进行色谱条件优化时，如遇到色谱图中多个峰难以分离、色谱峰风行不理想时，除了考察流动相比例及色谱柱外还可以考虑对的酸的种类、加入比例等进行考察，同时检测波长尽量避免选择近紫外区，以免影响检测结果。

3.柱温箱——柱温（需要注意仪器配置的柱温箱功能，如安捷伦和岛津的某些仪器型号仅能升温不可降温，那么设置柱温后，室温需调整低于柱温至少5°，否则柱温控制不准，影响色谱重现）

4.检测器——紫外需要设置单波长（200~400nm）二极管阵列检测器可同时设置多波长采集，并可采集紫外（氘灯）及可见光（钨灯）全波长。蒸发光最主要设定的参数为雾化器温度、蒸发器温度、载气流量、响应时间。根据仪器的品牌及型号不同参数设置不同，如安捷伦1260，蒸发器温度非挥发性化合物设置80-90℃，半挥发性化合物设置20-30 ℃；雾化器温度25~90℃；蒸发光检测器通用性好，可以检测物紫外吸收及在可见光吸收的组分，但该检测器具有破坏性，即样品的溶剂挥发后检测。对于连接的气源要求为纯度>98%氮气或空气发生器，溶剂不可使用非挥发性流动相添加剂，如四氢呋喃增加基线噪音，缓冲盐不能挥发均不宜使用；关于废液，我们通常会废液瓶盖紧防止液体挥发，但蒸发光检测器使用时特别需要注意的是，废液瓶不能盖盖，废液管不能伸到废液面下，排气管不能弯曲，否则会导致色谱峰裂分、基线不平等问题。

药学院  中药药剂学

刘吉爽 19400080052